神經性貝類毒素HPR酶標抗原

神經性貝類毒素(neurotoxic shellfish poisoning，NSP)主要是指從一種赤潮生物短裸甲藻(Ptychodiscusbreve)中分離出的一類毒素——短裸甲藻毒素(brevetoxins，PbTx)的理化特性和藥理特性與西加毒素(CTX)相似。PbTx可引起魚類、軟體動物、甲殼動物、海綿動物、棘皮動物及底棲藻類的大量死亡。有毒的短裸甲藻被貝類攝食后，其毒素在體內積累，并通過食物鏈傳遞給人類，引起食物中毒。中毒的主要癥狀為瞳孑L放大，身體冷熱無常，惡心、嘔吐、腹瀉，運動失常，但沒有麻痹感。因此，為了與引起麻痹作用的DSP相區別，稱為神經性貝類毒素。NSP中毒癥狀持續時間較短，一般從10min～20h。

免疫分析法是基于抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法，即根據抗原-抗體反應，采用特異性抗體來檢測藥物、激素、蛋白質、微生物等物質的定量分析方法。免疫分析法主要包括酶聯免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、放射性免疫法、熒光免疫法等，具有方便、快速的特點，但也存在一定的缺點，如費用較高、毒素之間的交叉反應難避免、實驗結果重現性較差等。

ELISA是檢測海洋生物毒素所采用的主要免疫方法。該技術可用目測，也可用酶標儀測定光密度值，具有易定性定量的優點^[6]。Tsao等^[7]采用單克隆抗體ELISA檢測法檢測ASP中的軟骨藻酸(domoic acid, DA)，并建立了基于單克隆抗體的膠體金免疫條檢測法；該方法的檢測限為5 ng/mL，在10 min內就可完成測定，提示免疫條檢測可用來快速檢測貝類樣品中的DA。也有研究者建立了基于基因工程單鏈抗體競爭ELISA檢測方法，該方法最大的優勢是毒素可在大腸桿菌中快速、大量得到表達，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于檢測或其他用途；對該方法進行驗證發現，其與標準高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)檢測結果有較好的相關性^[8]。李軍濤等^[9]建立DSP免疫熒光層析試紙條檢測方法，靈敏度可達0.125 μg/mL，達到我國貝類產品中DSP所允許的*。Dubois等^[10]建立了間接競爭ELISA方法檢測STX，該方法用毒素的偶聯物免疫產生的抗體來檢測貽貝、牡蠣和扇貝中的STX類毒素；在檢測之前，用90%的乙醇溶液將STX類毒素從貝類組織里快速提取出來，該方法的*檢測限為5 μg/kg。Garthwaite等^[11]也建立了4類貝毒的ELISA方法，均可滿足貝類提取物中樣品的鑒定，且樣品回收率較高。TTX為氨基全氫喹唑啉型化合物，是自然界中所發現的毒性最大的神經毒素之一^[12]。Thattiyaphong等^[13]建立了一種側流免疫層析技術來實現TTX的快速檢測，并運用該方法檢測了河鲀及食用魚中TTX的含量；與液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)相比，該方法的靈敏度為94.0%，特異性為92.4%。總的來說，側流免疫層析技術可用于大批量樣本的篩選，陽性結果的樣本再使用LC-MS/MS進行確認，減少了LC-MS/MS的測試量，降低了檢測成本。Reverte等^[14]開發了一種基于雙硫醇自組裝單分子膜的新ELISA方法，該方法可用于檢測河鲀中TTX的含量，檢測限為0.23 mg/kg，其與LC-MS/MS法的相關性為0.991。

大田軟海綿酸(okadaic acid, OA)是DSP中的主要成分，屬于聚醚類海洋生物毒素，尚無致死病例，但長期攝入可以致畸及致癌^[15]。劉仁沿等^[16]通過細胞融合，制備抗OA單克隆抗體和膠體金標記抗體，建立快速檢測OA的免疫層析試紙條分析方法，該方法檢出限為500 ng/mL。該研究組在此基礎上進行改進，使用卵清蛋白合成高耦聯比的包被抗原，以硝酸纖維素膜為載體，改進后方法檢測限達12 ng/mL^[17]。張洋等^[18]采用自行研發的免疫膠體金試紙條對雙貝殼類DSP的主要成分OA的污染情況進行調查，通過與ELISA檢測法的結果進行比較，發現該方法檢測結果準確可靠，未出現假陽性結果。Johnson等^[19]對4種已經商業化的快速檢測試劑盒是否可檢測英國雙殼貝類中的DSP進行驗證。這4種試劑盒包括1種ELISA試劑盒、1種蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)試劑盒以及2種側流免疫測定(lateral flow immunoassay, LFI)試劑盒。實驗結果表明，ELISA與LC-MS/MS具有較好的相關性，且不存在結果偏大的情況，但是存在假陰性結果；2種LFI試劑盒與LC-MS/MS檢測結果大部分具有一致性，但存在假陰性結果。總的來說，選擇何種方法去檢測DSP主要取決于檢測要求、實驗室的條件、實驗人員是否經過訓練以及對結果的要求是半定量的還是定性的。